/  導讀  /

2022年7月，上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院張旻教授團隊與華盛頓大學、福州肺科醫(yī)院專家在Frontiers in Cellular and Infection Microbiology（IF=6.073）雜志發(fā)表了一篇前瞻性研究，通過群體感應(QS)系統(tǒng)評估、全基因組測序（WGS）、進化實驗等方法，評估非囊性纖維化支氣管擴張（NCFB）患者在慢性銅綠假單胞菌肺部感染過程中是否會產生lasR突變的耐藥選擇并闡述其機制。迪飛醫(yī)學作為共同作者參與了該研究的數(shù)據(jù)分析。

/  研究背景  /

銅綠假單胞菌是一種常見的機會致病菌，可引起非囊性纖維化支氣管擴張(NCFB)患者的慢性感染并釋放多種毒力因子，導致發(fā)病率升高、生活質量下降和治療負擔增加。因銅綠假單胞菌對抗生素的顯著耐藥性，要根除它已經變得越來越困難。

多重耐藥（MDR）的發(fā)展可以影響銅綠假單胞菌分離株的進化和適應，并促進其成為慢性感染患者的頻繁定植者。在這個過程中，細菌的某些生理系統(tǒng)功能可能會發(fā)生改變，群體感應(QS)就是其中之一。銅綠假單胞菌利用QS系統(tǒng)，以依賴細胞密度的方式調節(jié)數(shù)百個基因的表達，其中許多基因編碼分泌毒力因子，如蛋白酶、彈性蛋白酶、氰化氫和吩嗪，這使得QS系統(tǒng)組分成為抗毒治療的潛在靶點。QS系統(tǒng)由許多小信號分子介導，包括N -3-氧-十二烷基高絲氨酸內酯(3OC12-HSL)和N-丁醇-高絲氨酸內酯(C4-HSL)，這兩個關鍵信號分層激活LasR-LasI系統(tǒng)和RhlR-RhlI系統(tǒng)。3OC12-HSL是LasI合酶的產物，當其環(huán)境濃度增加到閾值時，可與轉錄激活劑LasR結合，激活一系列基因，包括編碼C4-HSL信號合酶的rhlI和編碼C4-HSL受體的rhlR。

慢性肺部感染患者中分離的銅綠假單胞菌常缺乏QS，但lasR突變型菌株是最常見的，有報道其頻率超過30%。這一現(xiàn)象背后的機制仍然不為人所知。可能有一個強大的選擇壓力，使lasR突變體可能在一定的生長條件下具有生理優(yōu)勢。此外lasR突變體的出現(xiàn)也得益于QS野生型菌株產生的胞外產物。既往研究報道，lasR突變體是在需要QS條件下的長期培養(yǎng)過程中從野生型祖先進化而來的，與野生型親本共培養(yǎng)時具有選擇優(yōu)勢。以往研究表明，銅綠假單胞菌MDR的出現(xiàn)和QS功能之間存在相互作用。一方面，QS通過調控多藥外排泵基因的表達，促進MDR的發(fā)生；另一方面，QS系統(tǒng)本身也受到多藥外排泵表達的影響。目前外排泵對QS的影響是否會在臨床銅綠假單胞菌菌株中形成對LasR活性的選擇壓力尚不清楚。

本研究收集了NCFB患者呼吸道分離的銅綠假單胞菌，比較了MDR和非MDR菌株的QS表型。通過全基因組測序(WGS)和進化實驗，研究MDR機制對lasR突變體進化的影響。

/  研究內容  /

研究前瞻性納入為期2年的雙中心慢性銅綠假單胞菌肺部感染成人患者，入組標準為確診為NCFB且下呼吸道樣本銅綠假單胞菌培養(yǎng)重復陽性的患者，銅綠假單胞菌感染持續(xù)14天以上。排除了與其他檢測到的病原體共定植的患者。MDR銅綠假單胞菌定義為對三種或三種以上抗假單胞菌類藥物(如碳青霉烯類、氟喹諾酮類、青霉素類/頭孢菌素類和氨基糖苷類藥物)的獲得性不敏感。

患者臨床特征

共97例銅綠假單胞菌慢性肺部感染患者納入分析，其中非MDR定植63株，MDR定植34株。單因素分析發(fā)現(xiàn)，與非MDR相比，MDR患者感染持續(xù)時間明顯更長，先前接觸碳青霉烯類的頻率也更高。進一步的多變量分析顯示，只有先前碳青霉烯類暴露可以獨立預測MDR銅綠假單胞菌株的分離(OR: 24.9, 95% CI: 5.2-156.0, p <0.0001)。

MDR分離株缺乏QS表型

每例患者選擇一個分離株確定是否為MDR，比較MDR和非MDR菌株之間的QS表型，包括信號分子（3OC12-HSL 和 C4-HSL），毒力因子（綠膿菌素和蛋白酶）。結果發(fā)現(xiàn)，與非MDR分離株相比，MDR分離株中QS控制的信號分子和毒力因子的產量明顯降低。且這些表型在MDR分離株中比在非MDR分離株中表現(xiàn)出更多的異質性。總體而言，在所有樣本中，MDR分離株的QS表型均較非MDR分離株差，支持慢性肺部感染過程中出現(xiàn)QS缺陷與銅綠假單胞菌的MDR發(fā)生相關。此外通過測量MDR分離株在有或沒有3OC12-HSL的情況下生長18 h后的QS控制毒力產量發(fā)現(xiàn)，降低的毒力產量不能通過外源性添加3OC12-HSL得到顯著補充，表明MDR分離株的QS表型缺乏與LasR的功能障礙有關，而不是LasI。

為了確定QS缺陷表型的出現(xiàn)與MDR特征之間是否存在進化關系，研究分析了來自不同患者的11對分離株, 7例分離株從非MDR轉向MDR，而其他4例分離株保持非MDR。發(fā)現(xiàn)在MDR轉移患者的分離株中，復發(fā)分離株的QS表型明顯較初始分離株差；但在維持非MDR的患者中，復發(fā)株和初始株之間的QS表型沒有顯著差異。表明QS缺陷表型發(fā)生在銅綠假單胞菌株MDR發(fā)生之后。

WGS確定MDR決定因素和QS基因突變

為闡明研究人群中MDR分離株的QS缺陷表型機制，研究篩選了30個體外生長速度與實驗室菌株PAO1相似的菌株進行WGS。這些分離株包括來自不同患者的24株分離株和來自同一患者的3對分離株。采用單核苷酸變異分析來確定測序分離株之間的遺傳親緣程度。分析結果顯示，這些分離株之間的遺傳多樣性很高，哪怕是來自同一患者的成對分離株也具有差異性。

耐藥決定因素突變結果顯示，未發(fā)現(xiàn)含有碳青霉烯酶基因的分離株；14個(93.3%)MDR分離株和11個(73.3%)非MDR分離株含有oprD的非同義突變，可能導致功能性oprD表達的喪失。比較MDR分離株與非MDR分離株的oprD非同義突變頻率，兩組間并無顯著差異。其他耐藥決定因素如ampC、ampR、ampD和dacB中雖然也存在非同義突變，但幾乎都是錯義突變，并無移碼突變或者過早終止子突變，提示這些基因突變在分離株的耐多藥發(fā)展中并沒有發(fā)揮主要作用。

28株分離株(14MDR分離株和14株非MDR分離株)在lasR-I和rhlR-I系統(tǒng)中存在非同義突變，與實驗室菌株PAO1不同。rhlI是最常見的QS系統(tǒng)突變基因，其非同義突變存在于26個分離株中。但其突變頻率在MDR分離株和非MDR分離株之間無顯著差異。lasI 和 rhlR基因突變只存在于2個分離株中，很少見。8株分離株存在lasR非同義突變，且?guī)缀跞繉儆贛DR組，只有一個來自非MDR分離株。這些數(shù)據(jù)表明在lasR-I和rhlR-I系統(tǒng)中，lasR基因的非同義突變頻率在MDR分離株中顯著高于非MDR分離株。

比較MDR和非MDR的QS基因(lasR和RhlI)和外排泵調節(jié)基因(mexR、nalC、nalD、mexZ和nfxB)的同義和非同義突變頻率，并分析這些頻率之間的相關性發(fā)現(xiàn)，同義突變頻率在兩組間無顯著差異，但MDR分離株lasR、nalC和mexZ基因的非同義突變頻率顯著高于非MDR分離株。相關性分析結果表明，對于同義突變頻率，lasR與外排泵調節(jié)基因（mexR, nalC和mexZ）的呈顯著正相關，對于非同義突變，lasR僅與nalC和mexZ相關。計算這些基因的Ka/Ks比值以估計它們所經歷的選擇壓力，結果發(fā)現(xiàn)MDR分離株中l(wèi)asR、nalC和mexZ的Ka/Ks比顯著高于非MDR分離株。lasR的Ka/Ks比值與nalC和mexZ的Ka/Ks比值有顯著正相關性，支持MDR菌株中這些基因突變存在選擇壓力。

外排泵誘導的QS功能障礙的表型評估與進化實驗

使用外排泵抑制劑PAbN評價外排泵活性及其對QS活性的影響。是否添加PAbN對生長曲線基本無影響。非MDR分離株的QS表型在添加和不添加PAbN的培養(yǎng)基中無顯著差異。MDR分離株添加PAbN后，環(huán)丙沙星、頭孢他啶和美羅培南的MIC下降超過50％；同時其QS信號和綠膿菌素顯著增加。這些數(shù)據(jù)支持外排泵活性參與了這些菌株的MDR發(fā)展，導致QS信號分子和毒力因子產量低。

為了確定外排泵素對lasR突變的選擇壓力，分別對三個擁有完整lasR序列的QS-外排泵調節(jié)突變體（分離株17、20和24）進行了三個獨立的進化實驗。在九個實驗中，有七個在不同的時間出現(xiàn)了lasR突變體。為了證實群體表型歸因于外排泵活性的上調，我們通過添加外排泵抑制劑PAbN重復實驗。QS菌株和QS缺乏菌株之間都保持了穩(wěn)定的平衡，并使MDR菌株的表型與野生型PAO1相似。

/  總結  /

1、這項研究是為了驗證一個假設，即MDR的發(fā)展會對在NCFB患者定植的銅綠假單胞菌的lasR突變施加選擇性壓力。

2、臨床MDR分離株呈現(xiàn)QS缺陷表型，包括低產量的QS信號分子和QS控制的毒力因子。外源添加信號3OC12-HSL不能改善這些表型。

3、不同時間獲得的配對臨床分離株顯示其QS表型缺陷發(fā)生在MDR之后。WGS分析顯示，臨床MDR銅綠假單胞菌分離株外排泵活性上調，且lasR與外排泵調節(jié)基因nalC和mexZ的突變頻率呈正相關。

4、進化實驗表明，外排泵活性的上調促進了MDR分離株出現(xiàn)lasR突變。

5、綜上提示，慢性肺部感染時，MDR銅綠假單胞菌上調的外排泵活性易發(fā)生lasR突變?？筈S聯(lián)合外排泵抑制劑可能是MDR銅綠假單胞菌感染的NCFB患者的一種潛在治療策略。

6、不足之處：只納入了兩個中心的人群，這可能會限制研究結果對其他中心患者人群的推廣。另外不能排除其他機制參與MDR分離株中l(wèi)asR突變體進化的可能性，需要更多的研究來澄清。

原文鏈接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2022.934439/full

Ding F, Han L, Xue Y, Yang IT, Fan X, Tang R, Zhang C, Zhu M, Tian X, Shao P and Zhang M (2022) Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa is predisposed to lasR mutation through up-regulated activity of efflux pumps in non-cystic fibrosis bronchiectasis patients. Front. Cell. Infect. Microbiol. 12:934439. doi: 10.3389/fcimb.2022.934439

作者：山奈 吃吃個梨   審核：Zen-Master    排版：Moro